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泛素化蛋白檢測方法與應用

檢測樣品

泛素化蛋白檢測的樣品類型主要包括細胞裂解液、組織提取物以及純化后的蛋白質樣本。常見的實驗樣本來源于哺乳動物細胞（如HEK293、HeLa）、小鼠或大鼠組織（如肝臟、腦組織）以及體外泛素化反應體系。樣品需在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑和去泛素化酶抑制劑，以防止蛋白質降解及泛素信號丟失。

檢測項目

泛素化蛋白檢測的核心項目包括：

1. 泛素化修飾水平：通過定量分析目標蛋白的泛素化程度，評估其在特定生理或病理狀態下的調控機制。
2. 泛素鏈類型分析：鑒定泛素分子間的連接方式（如K48、K63鏈），明確其功能差異。
3. 泛素化位點定位：確定目標蛋白上泛素分子修飾的具體氨基酸位點。
4. 去泛素化酶活性：檢測去泛素化酶（DUB）對泛素化底物的水解效率。

檢測方法

泛素化蛋白檢測的主要方法包括：

1. Western Blot（免疫印跡）
   • 利用泛素特異性抗體或目標蛋白抗體，通過SDS-PAGE分離蛋白后轉膜，檢測泛素化條帶。
   • 需結合蛋白酶體抑制劑（如MG132）處理樣本以富集泛素化信號。
2. 免疫共沉淀（Co-IP）
   • 通過目標蛋白抗體沉淀復合物，結合泛素抗體驗證共沉淀蛋白的泛素化修飾。
3. 質譜分析（LC-MS/MS）
   • 對泛素化蛋白進行酶解后，通過液相色譜-串聯質譜鑒定泛素化位點及鏈類型。
4. 熒光報告系統
   • 構建泛素-熒光素酶融合蛋白，通過熒光信號變化實時監測泛素-蛋白酶體通路活性。

檢測儀器

1. 蛋白質電泳系統：用于SDS-PAGE分離蛋白，常用設備包括Bio-Rad Mini-PROTEAN系列電泳儀。
2. 轉膜儀：將凝膠中的蛋白轉移至PVDF或硝酸纖維素膜，如Trans-Blot Turbo快速轉印系統。
3. 化學發光成像儀：檢測Western Blot信號，例如GE Healthcare Amersham Imager 600。
4. 高效液相色譜-質譜聯用儀（HPLC-MS/MS）：用于高精度泛素化位點分析，如Thermo Fisher Q Exactive系列。
5. 熒光酶標儀：動態監測泛素化相關熒光信號，如Molecular Devices SpectraMax M5。

應用場景

泛素化蛋白檢測技術廣泛應用于癌癥機制研究、神經退行性疾病（如阿爾茨海默病）的分子病理分析，以及藥物開發中靶向泛素-蛋白酶體通路的抑制劑篩選。通過上述檢測方法，研究者可深入解析蛋白質穩態調控網絡，為疾病治療提供新策略。

（本文內容僅供參考，具體實驗方案需結合研究目的優化。）

實驗儀器

測試流程

注意事項

1.具體的試驗周期以工程師告知的為準。

2.文章中的圖片或者標準以及具體的試驗方案僅供參考，因為每個樣品和項目都有所不同，所以最終以工程師告知的為準。

3.關于（樣品量）的需求，最好是先咨詢我們的工程師確定，避免不必要的樣品損失。

4.加急試驗周期一般是五個工作日左右，部分樣品有所差異

5.如果對于（泛素化蛋白檢測）還有什么疑問，可以咨詢我們的工程師為您一一解答。